许多具有生物活性的生物大分子和亚细胞器很不稳定,在分离过程中要求温度低,操作温和,不能应用一般的化学分离方法,因此需用到赫西仪器生产的3H20RI高速冷冻离心机。如常用差速离心法分离亚细胞器、线粒体、微粒体和细胞核等,在分离亚细胞的过程中要注意尽可能地保存其原来活性和结构形态。
试剂:
1、0.25mol/L蔗糖液100ml,pH7.5
称取蔗糖8.6g溶于少量重蒸馏水,用1mol/LNaOH调整pH7.5,1mol/LNaOH的用量约0.75ml,再加蒸馏水至100ml即可。4℃可保存一周。
2、MA液:4℃保存1~2周。
0.25mol/L蔗糖液8.6g/100ml
10mmol/L Tris-HCL液0.12g Tris/100ml用HCL调pH8.0(约1mol/L HCL0.215ml)
3mMMgCl20.061g/100ml
先配制Tris-HCL液,用该溶液溶解蔗糖和MgCl2至100ml
3、MB液:4℃保存1~2周
配制同MA液,在MA溶液中加0.1ml Triton X-100/100ml
4、MC液:4℃保存1~2周
2.2mol/L蔗糖75.3g/100ml
5、0.4mol/L KCl溶液:2.98g/100ml
6、10%过氯酸(PCA):取99.8%过氯酸100ml加水至100ml
7、二苯胺—冰乙酸溶液:(新鲜配制)
称二苯胺1.5g溶于100ml冰乙酸中,再加浓硫酸1.5ml
8、1mol/L NaOH
9、0.01%甲烯兰溶液
操作
(一)细胞器的分离过程
1、肝匀浆制备:将大鼠断头放血处死,迅速取出肝脏,用生理盐水冲净肝脏表面的血液,剔去结缔组织,称取1.0克肝组织,剪碎放入盛有0.25mol/L蔗糖液3ml的Tefion-glass匀浆器内,接上电动马达匀浆,直至无肉眼可见的组织残块,再把匀浆倒入离心管,用0.25mol/l蔗糖液2ml冲洗匀浆管,一并放入离心管。
2、线粒体和细胞核的分离,按表操作。
(二)细胞器的鉴定:
1、线粒体的鉴定:在线粒体内有由氧化还原酶类组成的呼吸链,包括NADH氧化呼吸链和琥珀酸氧化呼吸链。在生理条件下,底物脱下的氢可经呼吸链彻底氧化生成H2O,并释放出能量。
但在体外可用甲烯兰(MB)作为受氢体。MB按受H2则变成甲烯白(MBH2),颜色由兰色变白色。
2、细胞核的鉴定:
(1)显微镜观察:用HE染色法,在镜下观察核的形态。
(2)用Burten's法测定DNA浓度:DNA是细胞核内的特征性物质。各种动物的细胞核所含的DNA量是十分恒定的,不受生理条件、环境因素等的影响。因此可用测定DNA含量来鉴定细胞核。
取水解上清液1ml放入T管,取10%过氯酸1ml放入B管,分别加二苯胺液4ml于T、B管中摇匀后,置80℃水浴10min,取出冷却后,在分光光度计上(600nm)测吸光度,查标准曲线或用标准管直接计算。
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