目的
1、掌握测定血浆HDL—胆固醇的原理及方法
2、了解血浆HDL—胆固醇临床意义,进一步加深对脂蛋白结构与代谢有关内容的理解
原理
高密度脂蛋白是血浆脂蛋白的一种,起初由肝脏和小肠合成,分泌至血液循环时呈圆盘状称为新生HDL。在循环中或组织细胞中LCAT(磷脂酰胆碱—胆固醇脂酰基转移酶)的催化下,新生的HDL与其它脂蛋白相互作用,使颗粒表面的胆固醇接受磷脂转移酶转移来的脂酸转变为胆固醇酯,此非极性的胆固醇酯进入疏水核心,使盘状的HDL逐渐转变成球形的成熟的HDL。HDL不仅能与其它脂蛋白互相作用转移其组成成分,而且能将组织细胞的胆固醇运输到肝脏而排泄(或变成胆酸而排泄)。HDL是由蛋白质、磷酯、胆固醇、甘油三酯按一定比例组成的。大量流行病学研究表明,血浆HDL水平与冠心病的发病率呈负相关,高水平HDL有利于预防冠心病的发生。
一定浓度的肝素—Mn混合液在一定条件下可选择性地使血浆中VLDL及LDL沉淀起来,而HDL仍留在上清液中,从而使HDL与LDL及VLDL分开。HDL中含有一定的胆固醇。利用胆固醇的类脂性质,可用有机溶剂进行抽提,然后取一定量抽提液蒸干,加入冰醋酸,利用Zak氏三氯化铁显色法,使溶解于冰醋酸中的胆固醇在硫酸存在的条件下与高铁离子作用,产生稳定的红色物质。此物质在560nm波长有最大吸收,可作定量分析。
试剂
1、标准胆固醇液:
a. 贮存液(1000μg/ml):准确称取胆固醇标准100mg溶于100ml三氯化铁冰醋酸溶液中。
b. 应用液:(80μg/ml):取贮存液4ml加三氯化铁冰醋酸至50ml。
2、三氯化铁冰醋溶液:
a. 贮存液(125mg/ml):取1.25克三氯化铁溶于100ml冰醋酸中
b. 应用液(1mg/ml):取贮存液2ml加冰醋酸至250ml
3、浓H2SO4(要求AR)
4、丙酮—乙醇混合液(按1:1比例配制V/V)
5、肝素—Mn混合液
a. 1.06mol/L氯化锰液(MnCl2·4H2O,MW198):取209.9克MnCl2·4H2O溶于1000mlH2O中
b. 肝素液(280mg/ml):取肝素280mg溶于1.0ml水溶液中。
c. 肝素—Mn混合液:取a液10ml+b液0.6ml混匀即成。
临用前配制,放冰箱保存,至多用一个月。
操作
1、HDL的分离
取干燥离心管一支,取0.5ml血浆加肝素—Mn混合液0.05ml,混匀后室温静置10min。放入TDZ5台式低速离心机中,设定3000转/分离心10min。沉淀部分为VLDL和LDL,而HDL存在于上清液中。
2、HDL—胆固醇的提取(有机溶剂抽提法)
取肝素—Mn沉淀后的上清液0.1ml,加酮醇混合液2.5ml(快速加入,使沉淀均匀),放入TDZ5台式低速离心机中,3000 转/分离心5~6min。取上清液2 ml于沸水中蒸干,此为样品管(沉淀部分为蛋白质)。
3、胆固醇测定取短试管三支,按下表操作,注意加H2SO4时需将试管斜置,沿管壁加入
试剂(ml)管号
空 白
样 品
标准(80μg/ml)
三氯化铁冰醋酸溶液
1.5
1.5
0.5
标准胆固醇(ml)
—
—
1.0
浓硫酸(ml)
1.0
1.0
1.0
摇匀,60℃水浴10分钟,560nm比色。记录吸光度。
计算公式:
血清HDL—胆固醇(mg%)=A样/A标×C标×K(mg/dl)
K=(0.5+0.05)/0.5×(0.1+2.5)/2×1/0.1×100/1000=1.1×1.3=1.43
临床意义及正常值:
正常人血浆总胆固醇为125~200mg%,HDL中所含的胆固醇占总胆固醇的1/3~1/4,人们常用HDL中胆固醇的含量表示HDL的量。
HDL—胆固醇水平愈高,愈有利于将组织中的胆固醇运输出来,对人们健康长寿十分有益,
长期坚持体育锻炼者,其血浆HDL胆固醇较一般人为高,冠心病者比一般正常人低,临床在测定血脂时也测定HDL—胆固醇的含量,对于诊断冠心病以及观察治疗效果有一定意义。
本文实验所使用的TDZ5台式低速离心机(http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-18/71.html)系湖南赫西仪器装备有限公司研发生产,该款离心机安全美观使用;采用TFT大屏幕液晶显示、触摸面板;采用全钢结构,不锈钢离心腔,坚固耐用;采用无刷变频电机,免维护,无粉尘污染;提供10组升降速率选择,可储存20个运行程序。
- 上一篇:离心机转子概论
- 下一篇:细胞器的分离和鉴定
- 相关链接:
- 离心机转子概论
- 离心机转子的安装
- 离心机选型基本原则
- 离心浓缩仪---芦笋精加工利器
- 真空离心浓缩仪的启示---创新的魅力
- 离心管的选购注意事项
- 常见冷冻干燥设备
- 真空浓缩设备科普知识
- 财务人员参加离心机产品基础培训
- 赫西离心机培训让我受益匪浅